Crio-Microscopia Elettronica: uno sguardo verso l’infinito

La Cryo-EM di per se non è nulla di nuovo. La tecnica consiste nel congelare rapidamente un campione biologico da visualizzare per poterlo immobilizzare e bombardare di elettroni. Ma molte cose sono radicalmente cambiate negli ultimi anni per darci una sorta di versione 2.0 che ci permetterà di eliminare molte zone d’ombra del nostro sapere.
Thomas Vaccari, 17 Maggio 2016
Micron
Micron

Università degli Studi di Milano Statale

 

Avete presente quando avete acceso per la prima volta il vostro nuovo televisore ad alta definizione, dopo esservi sbarazzati del vecchio tubo catodico? Che meraviglia e che dettagli mai apprezzati prima!
Chi l’avrebbe mai detto che il tatuaggio sull’avambraccio di Kobe Bryant dicesse: “I love Science”? Il paragone tra un vecchio televisore e l’alta definizione è utile per dare un’idea di quello che sta veramente succedendo nel campo della Crio-Microscopia Elettronica – in breve Cryo-EM, – una tecnica per fotografare l’infinitamente piccolo.La Cryo-EM di per se non è nulla di nuovo. La tecnica consiste nel congelare rapidamente un campione biologico da visualizzare per poterlo immobilizzare e bombardare di elettroni. Questi rimbalzano sul campione e poi vengono catturati da un sensore che ne restituisce l’immagine. Il congelamento rapido è un modo per preservare una struttura biologica senza che si formino cristalli di ghiaccio che la danneggino (in gergo il processo si chiama ‘vetrificazione’) e il  “bombardamento di elettroni” è alla base della microscopia elettronica, una tecnica quasi centenaria che si usa per visualizzare cellule intere o anche tessuti. Il loro matrimonio è avvenuto già negli anni ’80 al Laboratorio Europeo di Biologia Molecolare (EMBL) di Heidelberg. Fino a qualche anno fa, il risultato di tutta questa complicazione era un’immagine simile a quella di un televisore di inizio secolo: sfuocata, sgranata, insomma un blob di difficile interpretazione.
Ma due cose sono radicalmente cambiate negli ultimi anni per darci una sorta di versione 2.0 della Cryo-EM. Una è l’hardware: i sensori che raccolgono gli elettroni, come per le macchine fotografiche, sono diventati incredibilmente più sensibili e piu’ veloci. La seconda è il software: i programmi che interpretano le immagini sono infinitamente più intelligenti e precisi a distinguere il segnale dal rumore di fondo. La combinazione di questi miglioramenti incrementali ha portato ad un salto qualitativo enorme a livello di quello che può essere visualizzato e della risoluzione, che ora è a livello di pochi Angstrom, un’unita di misura dell’infinitamente piccolo che corrisponde piu o meno alla dimensione degli atomi. Si è passati quindi da un blob, al vedere la forma dettagliata dei singoli amino-acidi, i mattoncini che compongono le proteine. Più o meno come scoprirsi rapiti dalla delicata cesellatura di una scultura, quando fino a poco tempo fa si poteva guardare solo il blocco di marmo sgrossato, prima che fosse scolpito.
Fino ad ora, per poter vedere le proteine a una tale definizione si doveva cristallizzarle, ovvero costringerle a organizzarsi come in un grano di sale e poi si doveva investirle con dei raggi X, ancora più potenti degli elettroni, generati da un sincrotrone. Questo metodo, chiamato “Cristallografia a raggi X” ci ha dato le prime strutture delle proteine come quella che fece vincere il Nobel a John Kendrew e Max Perutz nel 1962 e si usa tutt’ora con grande successo. Ha però il difetto che non sempre le proteine formano un cristallo, in particolare se sono troppo grandi, hanno forma irregolare o parti mobili o se sono inserite in una membrana.
La Cryo-EM versione 2.0 invece non ha nessuno di questi limiti. La corsa all’oro che ha scatenato negli ultimi due anni è impressionante e ci ha portato al vedere ad una definizione quasi-atomica un gran numero di complessi di proteine, aprendo scenari inimmaginabili. Un primo esempio è la struttura di un enzima batterico relativamente piccolo chiamato Beta-Galattosidasi.

Nel 2014 la nuova Cryo-EM ci ha permesso di guardarla a 3,2 Angstrom. L’anno scorso gli stessi autori si sono migliorati e sono scesi a 2,2 Angstrom, dimostrando che Cryo-EM compete con la Cristallografia a raggi X a livello di risoluzione.
L’alta risoluzione ora permette anche di generare immagini in cui visualizzare l’organizzazione spaziale di strutture cristallografiche già note all’interno di complessi composti da più proteine, come in un gigantesco puzzle 3D. È notizia recente la pubblicazione su Science della struttura della parte interna dei pori nucleari che non c’entrano con la pelle tatuata di Bryant, ma che invece regolano gli scambi tra il nucleo e il citoplasma delle nostre cellule.

Al di là delle ovvie ricadute per la biologia di base, quest’approccio applicato a proteine di interesse medico permetterà un salto di qualità nella nostra capacità di inventare nuovi vaccini e farmaci. Un esempio appropriato è la gamma-secretasi che, se mutata, causa l’Alzheimer. E’ in gran parte nascosta all’interno delle membrane cellulari, quindi negli anni ha resistito a molti tentativi di essere visualizzata. Alla fine, ce l’hanno fatta proprio per Cryo-EM un paio di anni fa. Un altro esempio è la recentissima struttura dell’involucro del virus Zika, pubblicata su Nature. In entrambi i casi, ora le vediamo talmente bene che la speranza è di poter disegnare farmaci che possano aderire esattamente alle loro forme.
Gli avanzamenti radicali del Cryo-EM portano con sé ovviamente anche dei limiti. I nuovi microscopi sono costosissimi, nell’ordine di parecchie milioni di euro, e generano quantità spaventose di dati. A tal punto che la comunità dei biologi strutturali sta richiedendo a gran voce la costruzione di centri condivisi dove poter acquisire le immagini e analizzare i dati. Inoltre, i nuovi algoritmi che ripuliscono i segnali dal rumore di fondo utilizzano una serie di modelli teorici che non trovano ancora un consenso assoluto e alcuni ricercatori temono che a volte introducano degli artefatti.
Nonostante i limiti di cui sopra, la rivoluzione è in corso e non passerà in televisione, parafrasando una vecchia canzone. A giudicare però dai recenti avanzamenti di altre tecniche di microscopia, la rivoluzione non sarà neanche limitata alla Cryo-EM. Infatti, miglioramenti incredibili si registrano anche nella microscopia ottica, che per guardare non usa elettroni o raggi X, ma normali fasci di luce. Pensate che con i nuovi sistemi di microscopia confocale a super-risoluzione si è riusciti a superare il limite massimo di risoluzione ottica, teorizzato dal fisico tedesco Ernst Abbe nel 1873.
In generale, è chiaro che riusciremo sempre più a guardare anche laddove prima non si poteva. Tutti questi miglioramenti ci permetteranno senza dubbio di eliminare molte zone d’ombra del nostro sapere. Il nuovo limite, comune a tutta la scienza moderna dei Big Data, sarà la nostra capacità di interpretare e comprendere, quindi non di guardare, ma di vedere. Siamo ben oltre San Tommaso, che non credeva a cio’ che non vedeva. Ora vediamo e tocca decidere a cosa credere.

n.d.r: Peccato, Kobe Bryant non ha un tatuaggio con “I love Science” ma comunque il Black Mamba ci mancherà.

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