Da messaggero a riparatore del DNA: la nuova vita dell’RNA

Negli ultimi anni il riconoscimento dell'importanza dell'RNA nei processi biologici è in aumento esponenziale, anche grazie alla scoperta di metodologie di osservazione diretta del ruolo delle molecole RNA nei processi cellulari e biologici. Uno degli sviluppi recenti e più importanti in questo campo è rappresentato dal metodo RATaR. Sofia Francia, dell’Ifom di Milano, guida insieme a Fabrizio d’Adda di Fagagna il gruppo che lo ha sperimentato e messo in opera. L’abbiamo intervistata.
Giuseppe Nucera, 25 Luglio 2019
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Un tempo considerato semplice messaggero di informazioni tra DNA e proteine, negli ultimi decenni l’RNA ha dimostrato di essere essenziale nella regolazione di diversi processi cellulari, come la modulazione del messaggio genico, la struttura della cromatina e vari aspetti della stabilità genomica direttamente implicata in patologie importanti come i tumori e l’invecchiamento.
Il riconoscimento dell’importanza dell’RNA nei processi biologici è in aumento esponenziale negli ultimi anni, anche grazie alla scoperta di metodologie di osservazione diretta del ruolo delle molecole RNA nei processi cellulari e biologici.
Uno degli sviluppi recenti e più importanti in questo campo è stato il metodo RATaR (RNase A Treatment and Reconstitution), sperimentato e messo in opera dal gruppo guidato da Sofia Francia e Fabrizio d’Adda di Fagagna dell’Istituto di genetica molecolare ‘Luigi Luca Cavalli-Sforza’ del Consiglio nazionale delle ricerche (Cnr-Igm) e dell’Ifom (Istituto Firc di oncologia molecolare) di Milano.
Il metodo, che permette di studiare le cellule ancora vive, quindi trattate in modo da renderle permeabili e manipolare così i processi biologici che avvengono al loro interno, è stato pubblicato nei mesi scorsi su Nature Protocols, disegnando un nuovo ruolo per l’RNA, quello di riparatore del DNA.
Per comprendere come questo metodo sia stato sistematizzato e che cosa di nuovo sia emerso dal mondo cellulare, abbiamo intervistato Sofia Francia dell’Ifom di Milano.

Il metodo che avete strutturato sembrerebbe aprire a una piccola rivoluzione biologica centrata su un nuovo ruolo del RNA. È così?
Fino a poco tempo fa l’RNA veniva vista come una molecola transitoria che portava il messaggio contenuto nel DNA, esclusivamente per generare una proteina che si pensava avesse tutte le funzioni sufficienti per la fisiologia della cellula.
Invece ora si è realizzato che la quantità di RNA non codificante, quindi che nasce da un gene atto non a produrre proteine ma solo RNA, è estremamente superiore rispetto a quello codificante. Questa già è stata una rivoluzione del paradigma. Quello che noi abbiamo contribuito a definire è che ha anche un ruolo protettivo del DNA che lo codifica perché ne media la riparazione una volta che viene danneggiato.
La relazione è quasi invertita: l’RNA che viene generato da un DNA danneggiato è essenziale per ricostruire l’informazione che era contenuta nel DNA originale.

Insomma, pur essendo prodotto dal DNA ne è il rigeneratore principale?
L’RNA non esprime le informazioni del DNA, ma diventa un attore attivo: viene codificato dal DNA ma è in grado a sua volta di generare e preservare l’informazione del DNA stesso, non solo di trasmetterle. Diventa un suo sottoprodotto che si prende cura di lui. Come un figlio che però da adulto può avere un ruolo di conservazione del benessere del DNA quando è rotto, danneggiato, quando è malato.
Il nostro metodo RATaR ci ha permesso di scoprire questa funzione riparatrice.

Da dove nasce questa vostra domanda di ricerca?
È emersa dall’osservazione empirica che l’inattivazione degli enzimi richiesti per produrre RNA non codificante portava a un difetto nella riparazione al DNA o alla risposta al suo danneggiamento.
La biologia tradizionalmente partiva dallo studio delle proteine, due nello specifico, che sappiamo essere fondamentali nella generazione di un’infinità di RNA, tra cui anche micro RNA. Noi abbiamo osservato che se si perdevano queste due proteine, la risposta al danno era difettiva. Da lì ci siamo domandati se era la proteina in sé o il prodotto del DNA, quindi l’RNA, a determinare questa riparazione difettosa.
Abbiamo scoperto che la funzione riparatrice del DNA dipende dalla produzione di questo RNA.

Il metodo RATaR permette di manipolare le attività biologiche di una cellula mantenendola viva grazie alla permeabilità della membrana cellulare, elemento però molto instabile. È stato un vantaggio o uno svantaggio questa caratteristica?
La cosa che rende questa tecnica appetibile è la sua ibridazione tra un metodo in vivo e un metodo in vitro. Infatti in un certo periodo noi la chiamavamo in vivro.
Questa caratteristica permette di avere cellule vive e non fissate, e il trattamento che noi facciamo rende la membrana particolarmente permeabile seppure non la disintegri. Quindi la cellula rimane come un sotto compartimento, mantiene una sua funzionalità e le sue attività enzimatiche.

Qual è lo scopo di questa vostra tecnica?
Vogliamo mettere dentro alla cellula dell’RNA, magari sintetico da monitorare oppure che derivi da una popolazione cellulare con delle mutazioni e quindi particolari specie di RNA.
Insomma, azzeriamo l’RNA di una cellula normale, se ne immette uno da una popolazione che abbiamo sperimentalmente deciso noi e andiamo a vedere dentro alla cellula che cosa è in grado di fare questo RNA specifico. Il nostro focus è stato in particolare alla risposta al danno al DNA.

E quale attività avete osservato da parte dell’RNA ingegnerizzato per il danno al DNA?
L’RNA immesso e ingegnerizzato si posiziona sul DNA nella cromatina che porta la stessa sequenza, quindi omologa. Una volta posizionato attira tutte le proteine che sono atte a segnalare alla cellula che c’è un danno, una lesione che deve essere riparata.
Nella nostra tecnica partiamo da cellule sane sicuramente in grado di risolvere il problema, cellule a cui abbiamo indotto un danno nel DNA attraverso tecniche specifiche, ad esempio con raggi x. Un danno controllato in una sequenza nota, la cui posizione nel nucleo è anche visibile grazie al fatto che si trova vicino a delle regioni che noi sappiamo marcare.

Quindi come viene riparato il danno al DNA?
Nel 2017 uscì una nostra pubblicazione che dimostrava come la cellula è in grado di riparare il danno al DNA: quando questo viene rotto, proprio sul danno si trascrive un RNA non codificante, che rimane sempre lì legato alla cromatina danneggiata, ma che funge come molecola di annidaggio di RNA più piccoli.
Questi RNA non codificanti, che sono generati in qualunque punto del genoma dove si rompe, non vanno ad inibire alcuna traduzione ma, interagendo con un RNA omologo espresso nel momento in cui si forma il danno al DNA, portano alcune proteine a rispondere con il danno del DNA attivando meccanismi di riparazione.
Quindi si ripara il danno del DNA senza inibire la traduzione di proteine. Un’azione localizzata e fortemente specifica.

Cosa altro avete scoperto attraverso il vostro RNA ingegnerizzato?
La cellula, per riparare il danno, produce il suo RNA. Noi invece impediamo che sia utilizzabile degradandolo dopo aver permeabilizzato la membrana. Allora inseriamo dei RNA ingegnerizzati che hanno la sequenza corrispondente a quella danneggiata sul DNA. Ciò che abbiamo osservato è che questo RNA va in effetti a posizionarsi sulla regione selezionata, ma solo se c’è il danno.
Se la regione, pur avendo la stessa sequenza, è sana l’RNA non si recluta.
Il punto focale dunque è che interagisco non col DNA in sé, ma con una modificazione, una sua espressione che avviene solo quando è rotto. Quindi con un altro RNA che è generato anch’esso dalla lesione.

Questa scoperta può avere implicazioni anche nella cura di determinate patologie?
In numerose patologie, molte regioni con sequenza nota vengono frequentemente interessate dal danno del DNA. Su queste si può immaginare di disegnare delle molecole attive che possano inibire la risposta al danno al fine di far morire, in modo selettivo, ad esempio le cellule tumorali piuttosto che quelle sane in quella particolare regione fragile.
Nel contesto patologico leucemico, ad esempio, si potrebbe pensare di disegnare delle molecole ingegnerizzate che inibiscono la produzione di questo RNA che abbiamo scoperto e, in questo modo, rendere particolarmente vulnerabile solo il clone che porta la traslocazione, ossia il danno al DNA, combattendo così solo il clone leucemico, la parte malata dell’individuo.

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